新型脱靶检测技术有望让CRISPR/Cas9走上临床

发布时间:2019-03-04



基因编辑工具最大的风险就在于其脱靶效应。此前,学界一直没有良好的检测脱靶效应的工具。这一技术在中国有望取得全新的突破,201931日,《科学》发表了一篇名为《胞嘧啶单碱基编辑会导致大量单核苷酸突变的脱靶》的研究论文,该研究建立了一种被命名为GOTIGenome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection)的新型脱靶检测技术。

 

该技术由中国科学院神经科学研究所(中科院脑科学与智能技术卓越创新中心)、上海脑科学与类脑研究中心、上海营养与健康研究所隶属的计算生物学研究所(中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所),斯坦福大学遗传学系,中国农业科学院深圳农业基因组学研究所等在内的研究机构合作建立。

 

此研究显著提高了基因编辑技术脱靶检测的敏感性,并且可以在不借助于任何脱靶位点预测技术的情况下,发现之前的脱靶检测手段无法发现的完全随机的脱靶位点,为基因编辑工具的安全性评估带来了突破性的新工具,有望成为新的行业检测标准。

 



而这一技术也让CRISPR/Cas9基因编辑工具再次得到关注,CRISPR/Cas9自从2012年被发明以来,其脱靶风险一直备受关注,如果将CRISPR/Cas9及其衍生工具用于临床的话,脱靶效应可能会引起包括罹患癌症在内的很多种副作用。

 

在此之前,人们推出过多种检测脱靶的方案。这些方法都存在一些局限性,不能高灵敏性检测到脱靶突变,尤其是单核苷酸突变。因此一种能够突破之前限制的脱靶检测技术,将会成为CRISPR/Cas9及其衍生工具能否最终走上临床的关键。人们迫切希望可以找到一种既能够不依赖于脱靶位点预测,又能有足够信噪比的精密脱靶检测手段。

 

为了实现以上目标,杨辉研究组与合作者建立了一种名叫“GOTI”的脱靶检测技术。这项研究的精妙之处是利用小鼠胚胎做实验。研究者在小鼠受精卵分裂到二细胞期的时候,编辑一个卵裂球,并使用红色荧光蛋白将其标记。小鼠胚胎发育到14.5天时,将整个小鼠胚胎消化成为单细胞,利用流式细胞分选技术基于红色荧光蛋白,分选出基因编辑细胞和没有基因编辑细胞,再进行全基因组测序比较两组差异。这样就避免了单细胞体外扩增带来的噪音问题。而且由于实验组和对照组来自同一枚受精卵,理论上基因背景完全一致,因此直接比对两组细胞的基因组,其中的差异基本就可以认为是基因编辑工具造成的。

 



借助于GOTI系统,团队成员先是检测了最经典的CRISPR/Cas9系统。结果发现,设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应,结束了之前对于CRISPR/Cas9脱靶率的争议。然而团队还检测了另一个同样被给予厚望的CRISPR/Cas9衍生技术BE3,这个系统可以精确引入点突变,在之前的研究中从未发现过有明显的脱靶问题。然而在GOTI的检测下发现,BE3存在非常严重的脱靶,而且这些脱靶大多出现在传统脱靶预测认为不太可能出现脱靶的位点,因此之前方法一直没有发现其脱靶问题。

 

团队分析后认为,这些脱靶位点有部分出现在抑癌基因上,因此经典版本的BE3有着很大的隐患,目前不适合作为临床技术。研究团队的这些重要发现,证实了以BE3为代表的部分基因编辑技术存在无法预测的脱靶风险,让世人重新审视了这些新兴技术的风险。

 

检测出单碱基编辑技术有问题,是不是应该放弃对该技术的研究?答案是否定的。研究表明现有BE3等单碱基突变存在脱靶问题。但是很多人的遗传病是单碱基突变导致的。所以单碱基突变技术本身仍然存在巨大的价值。

 

有数据表明,全球有7000种罕见病,其中80%是单基因遗传病,50%发生在儿童时期。杨辉表示,接下来我们要做的主要是两件事,一个是进一步检测,看看它除了会导致异常基因突变以外还有没有别的问题。然后在此基础上,设法改进这个系统,建立一种不会脱靶,也没有其他风险的单碱基突变技术。